执业护士护理论文指导：皮肤损伤愈合过程中单核巨噬细胞及成纤维细胞均表达研究

摘要：皮肤损伤愈合过程包括炎症期、增生期、组织重建期111，在这期间，中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞是重要的参与细胞，中性粒细胞、单核细胞发挥的是清除异物及坏死物质的作用．而成纤维细胞发挥的是组织修复作用。研究表明，内源性大麻素(endo．cannabinoid．EC)系统能够参与许多生理功能调节，包括内源性大麻素、大麻素受体及合成与降解内源性大麻素的酶等【瓠。其中的大麻素I型受体(cannabi．noid receptor 1，CBlR)主要分布于中枢神经系统神经元突触前膜的G蛋白偶联受体(G proteincoupledreceptor，GPCR)，又称中枢性CBlR。Zheng等[31对紫外线引起的皮肤炎症及肿瘤的研究发现，紫外线辐射能直接激活CBlR。本研究应用免疫组织化学和Western印迹法研究在小鼠皮肤切创愈合过程中CBlR的定位表达及随时间的表达变化，为进一步研究CBlR的作用机制奠定基础。
关键词：法医病理医学；伤口愈合；皮肤；受体，大麻酚，CBl；小鼠
目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区大麻素I型受体(cannabinoid receptor I，CBlR)的表达及不同时间的变化规律。方法应用免疫组织化学和Westem印迹法检测小鼠皮肤切创后不同时间段CBlR的变化情况。结果正常组织中有少量CBlR的表达，位于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层。伤后6～12h。中性粒细胞不表达CBlR，伤后1～5d，阳性染色以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后7～14d，CBlR阳性着色以成纤维细胞为主。阳性细胞率6h一3d逐渐升高，5d达到高峰，7～14d逐渐降低。经Western印迹法显示各个时间段均有CBlR的阳性条带，其中5 d为CBlR表达的高峰。结论在皮肤损伤愈合过程中CBlR被激活。CBlR表达于单核细胞，可能参与炎症反应。CBlR在损伤周边区表达于成纤维细胞，可能参与皮肤损伤后的愈合。其变化规律可用于损伤时间的推断。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1主要试剂兔抗小鼠CBlR多克隆抗体(ab23703，英国Abcam公司)，兔SP检测试剂盒(sP一9001，北京中杉金桥生物技术有限公司)，6条带预染Marker(立陶宛Fermentas公司)。组织／细胞裂解液(H10200，辽宁华特生生物技术有限公司)，蛋白酶抑制剂(H10210，辽宁华特生生物技术有限公司)，小鼠抗GAPDH单克隆抗体(加拿大SignalChem公司)，山羊抗兔IgG(ZB一2301)、山羊抗小鼠IgG(ZB一2305)及DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1．1．2动物模型制作及分组健康成年清洁级昆明系小鼠50只，雄性，体质量35～409。随机分为伤后0、6、12h和1、3、5、7、lO、14d及对照组，每组5只。乙醚气体吸入麻醉，剪毛处理，常规手术消毒，在背部中央做一纵行长1．5cm皮肤切创，深达筋膜，创面自然止血，不包扎，不施药。切创后每只小鼠给予清洁饲料及自来水，分笼饲养，并保持创口干燥，防止创口感染。分别于伤后0、6、12h及1、3、5、7、10、14d将小鼠脱颈椎处死，取伤口处1．0cmx1．5em皮肤组织。对照组小鼠取相同部位同等大小皮肤，但不做切口。
1．2方法
1．2．1切片制备每组1／2皮肤放人4％多聚甲醛PBS溶液中固定12h后，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作5斗m厚切片。
1．2．2常规HE染色切片脱蜡，水化。苏木素染色3min，在1％的盐酸一乙醇中分化数秒，自来水中返蓝30rain，1％伊红染色lmin，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1．2．3免疫组织化学染色切片脱蜡、水化，微波抗原修复后用3％H：O：孵育，正常用非免疫山羊血清孵育，兔抗小鼠CBlR多克隆抗体(1：200)作为一抗，应用SP免疫组织化学技术进行染色．DAB显色，苏木素核复染。染色中以PBS代替一抗作为空白对照。Journal of Forensic Medicine，August 2010，V01．26，No．4
1．2．4 Western印迹法检测冰浴下(4℃)将各时间段的另1／2皮肤剪碎，加入组织裂解液300斗L及蛋白酶抑制剂3斗L匀浆，机械破碎后，4qc下以离心半径9．35 cm，12000 r／min，离心30min，提取上清液，用BCA法测量蛋白浓度，将样本置于一80℃保存，备用。变性后，总蛋白量为40斗g。
进行12％SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白后．半干转法将蛋白转移到PVDF膜上。用5％的脱脂牛奶封闭2h．TTBS洗涤3次，用兔抗小鼠CBlR多克隆抗体(1：200)孵育，4℃过夜。TYBS洗涤3次后，与山羊抗兔IgG二抗(1：4000)室温孵育2h，TI'BS洗涤3次后。与DAB反应5rain，晾干，扫描，保存。
1．2．5统计分析采用SPSS 13．0软件包，应用方差分析对数据进行统计学处理。组间比较用t检验，数据应用孑拯表示，检验水准a--O。05。
1．3结果分析
1．3．1 HE染色结果分析CBlR阳性表达位于胞膜及胞浆．用DAB显色呈棕黄色。显微镜(x400)下。在每张切片损伤及其周边区内(距损伤区200t．Lm范围内)随机选择10个视野，计算每个视野中中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞的总数。
1．3．2免疫组织化学染色结果分析显微镜(x400)下．在每张切片损伤及其周边区内(距损伤区200t．Lm范围内)随机选择10个视野，计算每个视野包括中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞的阳性细胞，并计算每个视野中阳性细胞与3种细胞总数的比值(阳性细胞率)。
1．3．3 Western印迹法检测结果分析用平均灰度值(AVG)分析各时间段条带的大小和浓淡，该系统灰度值以O表示黑，255表示白，数值越小表示量越多。
2 结果
2．1 HE染色及细胞计数
伤后6h见创缘表皮胞浆均质化，细胞核消失，真皮内中性粒细胞浸润增多；伤后12h见皮下组织及创底有大量渗出的中性粒细胞及单核细胞；伤后1 d见大量以单核细胞为主的炎细胞浸润；伤后3d创口结痂．肉芽组织形成。中性粒细胞明显减少，肉芽组织向创腔内机化：伤后7d肉芽组织内见大量长梭形细胞核管腔样结构：伤后10～14d，创口基本愈合，损伤区及损伤周边区的中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞逐渐减少，间质增多，肉芽组织向瘢痕组织转变，表皮覆盖创口。不同时间段中性粒细胞、单核细胞及成纤维细胞的总数见。与相邻上组比较，P<>
2．2免疫组织化学染色及阳性细胞计数
正常小鼠皮肤组织内，表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层表达CBlR：伤后6h～1 d．CBlR主要表达于单核细胞，中性粒细胞不表达CBlR；3-5d，单核细胞逐渐增多，成纤维细胞开始出现．其阳性染色集中于单核细胞及成纤维细胞，并于5 d阳性细胞率达到高峰；7～10d，阳性细胞逐渐减少；14d，创口愈合，损伤区及损伤周边区成纤维细胞逐渐减少，以瘢痕组织替代。
2．3 Westem印迹法检测结果
以GAPDH(相对分子质量约为3．6x104)为内参，CBlR在对照组及实验组均有阳性条带，位于6．3x104处。实验组各时问段CBlR表达强度有一定规律，对照组和Oh组仅表达微弱的CBlR。6h一3d，表达逐渐增强，5d表达最强，7～14d表达逐渐减弱。
3 讨论
本研究中的Western印迹法检测结果与免疫组织化学的变化规律基本一致．体现出损伤后各时间段皮肤CBIR的含量变化。伤后5d是CBlR的含量高峰期，其他各组的平均灰度值有所不同。值得指出的是伤后714d。蛋白表达减少还可能与内源性大麻素的增加有关。GarciaGonzalez等【141研究发现，成纤维细胞暴露于一定剂量的CBlR激动剂24h后，去掉激动剂．CBlR蛋白的表达在72h内出现降低。并指出激动剂诱导CBlR蛋白表达被抑制。这可能也与GPCR的调节有关，有人研究激动剂能导致转染了的细胞系中．CBIR快速磷酸化并发生内吞【b一司，而且在激动剂连续存在的情况下。受体会被溶酶体降解，从而及时中止GPCR引起的下游信号通路放大作用。
经免疫组化和Western印迹法检测分析，CBlR在炎症期可能发挥促进炎症反应，在增生期可能发挥促进纤维化的作用，而CB2R在一些疾病的研究中有抗炎和抗纤维化的作用。并且已有研究证实在小鼠实验性真皮纤维化模型中激活CB2R能限制白细胞的聚集和真皮的纤维化旧。所以推断在皮肤损伤愈合过程中。EC系统中的两个受体在炎症期和增生期可能起到互补的作用。本实验中．激活CBlR的内源性大麻素和参与的酶尚待进一步研究，在皮肤切创愈合过程中CBlR参与的信号通路同样需要探讨，如果在研究中引入CBlR拮抗剂(SRl41716)、基因敲除、RTPCR等方法，则能更好地阐述CBlR对皮肤损伤愈合的机制。转载自『壹佰医学论文网』
内源性大麻素系统包括大麻素受体、内源性大麻素及合成与降解内源性大麻素的酶。两种大麻素受体，分别是CBlR和CB2R．CBIR主要分布于中枢神经系统．CB2R主要分布于免疫系统。CBlR除了参与中枢神经系统疾病如癫痫外，还参与能量代谢类疾病如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化及肝纤维化、多发性硬化等结缔组织疾病。
本研究通过免疫组织化学染色证明，小鼠正常皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺有CBlR阳性着色，这可能与维持皮肤稳态有关。小鼠正常皮肤的皮肌层有CBlR阳性着色。已有研究证实CBlR表达于人和啮齿类动物的骨骼肌141。并参与调节糖和脂质代谢[51。皮肤损伤修复过程中。只有单核细胞、成纤维细胞CBlR有阳性着色．中性粒细胞没有CBlR阳性着色，这可能与大麻素受体在白细胞的表达差异有关。有研究表明，白细胞中CBlR的转录水平为CB2R转录水平的1／10～1／100【q。伤后1。5d。阳性细胞率逐渐升高，提示CBlR可能参与在皮肤损伤后单核细胞对坏死组织和炎细胞的清除过程。Sugamura等同研究人的动脉粥样硬化斑块发现，巨噬细胞表达CBlR。而且人外周血单核细胞在向巨噬细胞分化的过程中，CBlR表达逐渐增强。张建军等JgJ发现在小鼠皮肤切创后l一5d，p-p38MAPK表达于单核细胞，并于3d达到高峰。而Han等191对动脉粥样硬化的研究中进一步发现．大麻素诱导的人巨噬细胞活性氧簇的产生是有CBlR参与的，巨噬细胞上的CBlR能诱导下游的p38MAPK的磷酸化，p38被激活后能调节活性氧簇的产生和随后的TNFQ和MCP一1的合成。CBlR通过活性氧簇的生成增加促进巨噬细胞的促炎反应。因此单核细胞CBlR的表达增强可能参与并促进炎症反应。同为位于巨噬细胞上的大麻素受体，CB2R在很多疾病如动脉粥样硬化、炎症性肠病抑制炎细胞的增殖、炎症因子的分泌。发挥抗炎的作用。伤后3d和5d阳性细胞率都相对较高，但是5d最高。3d时以单核细胞为主，并残存少量中性粒细胞，成纤维细胞刚开始出现。而在5d时是成纤维细胞和单核细胞重叠高峰，阳性细胞占细胞总数的比例增加。CBlR表达于成纤维细胞上，提示CBlR可能参与了皮肤损伤的愈合过程。研究表明，成纤维Journal of Forensic Medicine，August 2010，V01．26，No．4细胞在炎症介质刺激下CBlR表达增加．并沿细胞长轴伸长【1q。另外，TeixeiraClerc等111I发现人的肝硬化标本中CBlR表达增加，主要表达于在慢性肝损伤过程中转化为肌成纤维细胞的肝星形细胞。用四氯化碳制造的急性肝硬化损伤修复模型中，选择性CBlR拮抗剂或使用CBlR敲除小鼠能降低小鼠纤维化程度。纤维化程度降低伴随着肝TGF一13表达降低以及肝肌成纤维细胞的生长抑制和凋亡增加。这种效应可能与蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)和细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)的磷酸化程度降低有关。因而影响了细胞的增生和生存。因此推断CBlR参与调节肝纤维化，CBIR信号通路有促纤维化效应。Julien等【12I发现CB2R在肝纤维化的作用正好与CBlR相反，激活CB2R能产生有效的抗纤维化作用。伤后7．14d单核细胞和成纤维细胞CBlR的阳性表达强度逐渐减弱，可能与两种细胞发生凋亡有关。Guan等13l研究证实皮肤损伤愈合过程中单核巨噬细胞及成纤维细胞均表达Fas和FasL，部分共同表达Fas和FasL的细胞发生凋亡。