执业护士护理论文指导：基于优秀骨修复支架资料的研究

摘要：磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷（Apatite-Wollastonite glass ceramic，A-W GC）是近年开展起来的优秀骨修复支架资料，它具有良好的组织相容性、骨传导诱导性和降解性，无论在体内还是在体外状态下，均可为种子细胞提供良好的生长环境。
在体外状态下，种子细胞与载体复合后短时期内的贴壁数量占接种细胞总量的百分数，即初次贴壁率是骨组织工程体外组装效果的重要指标之一，由于种子细胞常常是高效的成骨细胞或携带目的基因的转染细胞，它成活的数量几直接与未来的成骨有关。
种子细胞在骨组织工程载体上粘附的主要方式是特异性粘附，经过对载体的外表停止修饰，增加载体壁的种子细胞特异性分离位点可进而进步初次贴附率。机体内的粘附分子分为4类，即整合素、钙粘蛋白、免疫球蛋白超家族、选择蛋白等，与骨组织工程关系亲密的是前3种 。资料植入体内后首先就是吸附血浆蛋白， 特别是与骨构成有关的细胞外基质， 如纤维粘连蛋白。经过对支架资料外表改性，吸附一定量的短肽序列在配体纤维粘连蛋白等，可在细胞与载体复合早期（此期细胞与基质粘附起重要作用）为种子细胞上的粘附分子提供更多的特异性粘附的分子分离点。曾有报道关于生物陶瓷吸附蛋白质的研讨，但由于蛋白质构造比拟复杂，很难从微观上解释其与载体的互相作用及变化机制。氨基酸是组成蛋白质等生物大分子的根本构造单元，谷氨酸是一种酸性氨基酸，分子内含两个羧基，在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要位置，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反响。课题研讨其和A-W GC之间的互相作用，希望从实质上了解生物大分子的吸附性质和作用机制，为之后的生物大分子吸附研讨提供一定的理论根底。
　　实验制备了A-W GC，运用谷氨酸溶液浸泡，讨论温度、时间、溶液pH 值、浓度等对吸附量的影响，讨论其在不同条件下的吸附规律。
　　2. 实验局部
　　2.1 原料及性能表征
　　2.1.1 原料与试剂
　　正硅酸乙酯（TEOS）；磷酸三乙酯（TEP）；四水硝酸钙；六水硝酸镁；氟化氢氨；无水乙醇；茚三酮，乙二醇，醋酸，醋酸钠，氯化亚锡，谷氨酸（Glu）均为剖析纯试剂。
　　2.1.2 A-W GC 性质的表征
　　采用 DX-1000X 射线衍射仪对A-W GC 停止物相剖析，采用JS94H 微电泳仪丈量不同pH 下A-W GC 的Zeta 电位。
　　2.1.3 谷氨酸规范曲线的绘制
　　2.1.3.1 茚三酮溶液的配制
　　称取 0.12g 茚三酮溶于4.5mL 乙二醇和1.5mL pH=5 的醋酸钠－醋酸缓冲液中，参加0.1g/mL 氯化亚锡（溶于乙二醇）1 滴。
　　2.1.3.2 谷氨酸的测定分别配制
　　浓度为 100、200、400、600、800、1000μg/mL 的谷氨酸溶液。依次参加0.5mL谷氨酸溶液和1mL 茚三酮溶液于50mL 比色管中，沸水浴5min，冷却至室温，蒸馏水定容至50mL，于波长570nm 处测定其吸光度，得吸光度（X）与谷氨酸浓度（Y, μg/mL）之间的直线方程： Y = 787.41X + 62.515，线形相关系数R = 0.9964。
　　2.2 实验办法
　　2.2.1 A-W GC 的制备
　　2.2.2 谷氨酸规范曲线的绘制
　　茚三酮溶液的配制：称取 0.12g 茚三酮溶于4.5mL 乙二醇和1.5mL pH=5 的醋酸钠－醋酸缓冲液中，参加0.1g/mL 氯化亚锡（溶于乙二醇）1 滴[22]。
　　谷氨酸的测定：分别配制浓度为100，200，400，600，800，1000μg/mL 的谷氨酸溶液。依次参加0.5mL 谷氨酸溶液和1mL 茚三酮溶液于50mL 比色管中，沸水浴5min，冷却至室温，蒸馏水定容至50mL，于波长570nm 处测定其吸光度，得吸光度（X）与谷氨酸浓度（Y,μg/mL）之间的直线方程： Y = 787.41X + 62.515，相关系数R = 0.9964[23]。
　　2.2.3 磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷对谷氨酸的吸附实验
　　谷氨酸吸附量的测定：高温烧制后的片状 A-W GC（每片0.16g），37 ℃下浸泡于2mL谷氨酸1h，取出用蒸馏水冲洗外表，枯燥后于37℃下浸于2mL 10g/L NaOH 1h，调理脱附液pH 至7 左右，分别取脱附液0.5mL 和1mL 茚三酮试剂于50mL 比色管中，沸水浴5min，冷却至室温，蒸馏水定容至50mL，于波长570nm 处测定吸光度，由规范曲线计算谷氨酸浓度，并依据下式计算A-W GC 对谷氨酸的吸附量：Q=VC/ （1000m）
　　式中，Q 为吸附量，mg/g；V 为吸附前谷氨酸溶液的体积，mL；m 为吸附剂A-W GC的质量，g；C 为所吸附谷氨酸溶液的浓度，μg/mL。
　　pH 值与吸附量关系的测定：片状A-W GC 分别浸泡于pH 值为1，2，3，3.4，6，7，8，9，、10 的2mL 谷氨酸溶液（600μg/mL）中，37℃下吸附1h，测定其谷氨酸浓度，计算吸附量。
　　时间与吸附量关系的测定：分取谷氨酸溶液（600μg/mL）2mL 于37℃下参加片状A-WGC，吸附0.5，1，2，3，4h，测定其谷氨酸浓度，计算吸附量。
　　温度对吸附量关系的测定：取谷氨酸溶液（600μg/mL）2mL，37℃下浸泡片状A-W GC，分别在温度为0，24，37，50，60，70，80℃时吸附1h，测定其谷氨酸浓度，计算吸附量。
　　浓度与吸附量关系的测定：片状A-W GC 分别参加2mL 浓度为100，200，400，600，800，1000μg/mL 的谷氨酸溶液中，37℃下吸附1h，测定其谷氨酸浓度，计算吸附量。
　　2.2.4 A-W GC 等电点的丈量丈量
　　不同 pH 下磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷的Zeta 电位，计算其等电点。当Zeta 电位值为0 时，pH=8.5 即为磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷等电点[24] 。
　　3. 结果与讨论
　　3.1 A-W GC 的晶相构造
　　从 X 射线衍射图谱（图3）上能够看到，在1100℃烧成的A-W GC 中，磷灰石和硅灰石的衍射峰明显呈现，且较锋利，随同着有二氧化硅和镁黄长石生成。据文献报道[25]，二氧化硅和镁黄长石成分有着高的生物活性，对A-W GC 的活性有着促进作用。
　　3.2 谷氨酸浓度对吸附量的影响
　　A-W GC初次对谷氨酸吸附的吸附等温线见图4。由图4能够看出，其吸附等温线契合S型曲线，属于Freundlich型吸附[26-27]，即并非简单的物理吸附，而是相伴着内部的化学吸附。
　　在物理吸附过程中，谷氨酸分子在其外表快速构成单分子层，然后以分子间引力构成多分子层吸附。化学吸附则是氨基酸羧基末端与Ca2+以离子键分离， 氨基末端与PO43-以离子键和氢键分离[28-29]吸附有谷氨酸的A-W GC重复洗脱再重新吸附，发现浓度对吸附量的影响关系见图5。谷氨酸浓度为100～200μg/mL时，吸附量随浓度增大而增长疾速；谷氨酸浓度为200～1000μg/mL时，增长速度放缓，最终到达饱和。这是由于初次吸附后，经过洗脱后再吸附，A-W GC内部分离位点多数仍被占领，不易脱下，所以尔后反复的吸附只能在外表停止单分子层物理吸附，吸附曲线因而也呈C型曲线，即属于Langmuir型吸附。随着谷氨酸浓度进步，吸附量增长趋向很大，当浓度超越600μg/mL后，吸附量增长趋向变缓。
　　3.3 pH 值对吸附的影响
　　氨基酸溶液pH值对吸附量的影响能够看出，整个曲线呈现M型，在pH＝3.4和pH＝8有两处峰，吸附量最大。
　　这是由于氨基酸具有两性离子的特性，在水中，氨基酸的存在方式随介质pH 值不同而变化。当介质pH 高于等电点pI 时，氨基酸表现为阴离子，当介质pH 低于等电点pI 时，氨基酸表现为阳离子。只要当介质pH 等于等电点pI 时，溶液中氨基酸阴离子和阳离子浓度才相等，此时氨基酸以两性离子方式存在。而谷氨酸分子是二元酸，为酸性氨基酸，pI＝3.22，当介质pH＝1～3.4时，谷氨酸呈2种状态，R+和R±，而此时介质pH低于A-W GC等电点，A-W GC外表带正电，由于同性排挤作用，吸附量不大；在介质pH＝3.4时，处于谷氨酸等电点左近，此时谷氨酸以R±状态为主，溶解度减小，呈电中性，在外表大量堆积，吸附量到达第1个最大值；在介质pH＝8时，谷氨酸也呈2种状态，R-和R2-，且以R2-为主，而此时介质pH仍低于A-W GC等电点，A-W GC外表带正电，依托静电作用，谷氨酸大量吸附在A-W GC外表，吸附量到达第2个最大值。
　　3.4 时间对吸附量的影响
　　吸附时间与A-W GC对谷氨酸吸附量的关系见图7。能够看出，在0.5～2h时，A-W GC对谷氨酸的吸附量随时间增加而增大，之后吸附量随时间延长增大不明显。这是由于在吸附起始阶段谷氨酸浓度大，在A-W GC外表以单分子层快速、大量停止物理吸附，到达0.52mg/g吸附值后，A-W GC外表吸附接近到达饱和，吸附液浓度降低，因此吸附量随时间增加而变化较小。
　　3.5 温度对吸附量的影响
　　吸附常常随同吸放热的变化，因而温度也是一个重要的影响要素，图8是不同温度下A-WGC对谷氨酸的吸附量曲线。
　　较佳温度为37℃，此时吸附量较大。在37~60℃时，随着温度升高，吸附量降低。这是由于吸附为放热过程，随着温度升高，谷氨酸溶解度增大，吸附减少。在60℃吸附量到达较小值，60～70℃发作化学吸附，谷氨酸分子与外表羟基分离，吸附量稍微增大，80℃时根本到达饱和。
　　4. 结论
　　本文经过溶胶凝胶法制备 A-W GC 前驱体，压片后在1100℃时煅烧。经过其吸附谷氨酸的溶液pH 值、时间、温度、谷氨酸浓度等影响要素的剖析：结果标明A-W GC 初次对谷氨酸吸附时属于Freundlich 型吸附，包括物理吸附和化学吸附。经吸附-洗脱循环后再吸附时仅在外表发作物理吸附，属于Langmuir 型吸附；在溶液pH＝3.4 和pH＝8 时，吸附量均较高；2h 内A-W GC 对谷氨酸的吸附量随时间增加而增大，尔后吸附量随时间变化不明显；37℃左右有利于A-W GC 对谷氨酸的吸附。
　　A-W GC 对短肽序列在配体纤维粘连蛋白的吸附实验将在后续研讨中停止。