摘 要：本文采用基因采矿方法从Genebank 中选取四株芽孢杆菌，以PCR 方法扩增了脱氧核糖醛缩酶(DERA)基因，并在E.coli 中实现过量表达。与E.coli K12 DERA(EcoDERA)相比，各种来源于芽孢杆菌的DERA 催化天然底物2-脱氧-D-核糖-5-磷酸(DRP)进行裂解反应的活性接近，但对非磷酸化底物2-脱氧-D-核糖(DR)的催化能力要远大于EcoDERA，且各种酶对两种底物的专一性常数之比([kcat/Km(DR)]/[ kcat/Km(DRP)])均比EcoDERA 高两到三个数量级，在热稳定性上也有明显优势，在70℃仍能保持40-65%的酶活。经活性位点比较发现四种酶底物结合位点具有相似的结构特征，EcoDERA 中Lys172，Phe200，Val206 和Ser239分别在BsuDERA，BliDERA，BamDERA 和BthDERA 中被Phe，Val，Ile 和Arg 全部或部分取代，分析表明这种替换可能影响底物结合位点静电环境变化和两个关键活性位点 Lys残基架构周围的疏水相互作用，因此影响底物专一性。
关键字：生物化学工程；脱氧核糖醛缩酶；基因采矿；底物专一性
0 引 言
天然酶作为高效的生物催化剂已经被广泛用于有机合成过程，研究者们也开发了各种技术以获取具有更高活性或更适底物专一性的酶，但是这些方法都需要从大量突变库中筛选出目标蛋白，因此突变库的多样性及筛选的通量是影响目的酶筛选的关键因素。利用基因采矿可以从海量的测序基因组信息中发现功能蛋白并应用于生物催化中，因此对已知基因组信息进行有效利用及预分析有利于提高筛选新酶的效率。
脱氧核糖醛缩酶，又称2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA，EC 4.1.2.4)因催化两个醛的可逆缩合而受到广泛关注，已被用于合成他汀类药物中间体，肿瘤抑制剂埃博霉素(Epthilone A）以及覆盆子酮前体4-羟基亚苄基丙酮等。其中，来源于E.coli 的EcoDERA由于对磷酸化底物有很强的偏好性而受到广泛关注，但其对非磷酸化的底物如氯乙醛，溴乙醛和叠氮乙醛等的催化效率却很低甚至不发生反应。在有机合成中，一般的底物均为非磷酸化底物，因此需要筛选出适应非磷酸化底物的DERA 并增加热稳定性以提高它们在合成上的应用效率。
现在已知晶体结构的DERA 有10种，通过定向进化和定点突变等手段使人们对其中与催化相关的结构有了更深的理解，而底物专一性相关结构的研究更有助于对其进行改造从而扩大其适应的底物范围。同样，利用这些结构信息及现有的生物信息学工具，人们可以很方便地在基因组数据库中搜索潜在的高性能酶，在对其结构和催化特性进行初步预测后，采用成熟的分子生物学技术对其进行克隆和过表达，作为新功能蛋白开发和改造的候选者。目前已有一些来源于耐高温古细菌Pyrobaculum aerophilum，Aeropyrum pernix 和耐高温细菌Thermotoga maritima，Thermus thermophilus 的具有较高热稳定性或来源环境基因组的高对映体选择性DERA 的报道，通过序列比对发现它们和革兰氏阳性细菌中的DERA 序列相似性较为接近，但和EcoDERA 的同源性却较远。因此本研究从四种已完成全基因组测序的革兰氏阳性芽孢杆菌出发，克隆、表达已预测的DERA，对其底物专一性进行表征，并根据已知的DERA 结构，基于活性位点比较分析这一类结构相近DERA 的特性。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
Quiagen QIAprep Spin Miniprep Kit(Axygen)用于质粒制备，QIAEXII Agarose GelExtraction Kitfaction Kit(Axygen)用于纯化DNA 片段。Primer star DNA 聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，限制性内切酶和T4 连接酶购自Fermentas。D-2-脱氧核糖-5-磷酸(DRP)，磷酸丙糖异构酶和甘油磷酸脱氢酶(GPD/TPI) (G-1881)购自Sigma，D-2-脱氧核糖(DR)购自BBI。HisTrap FFcolumns 购自GE 公司。寡核苷酸引物由上海Invitrogen 公司合成，DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司有限公司进行。所有其他的化学试剂均为市售分析纯。
测序仪为ABI PRISM 3730 自动测序仪。UV 检测及酶学测定使用全波长酶标仪Multishan Spectrum RE with cuvette(Thermo scientific)。
1.2 菌株，质粒与培养条件
实验所用菌株及用来设计PCR 引物的同源DERA 及所用引物，所使用和构建的质粒见表2。所有细菌均根据保藏中心所提供的说明进行培养，细菌基因组DNA 由天泽基因组抽提试剂盒从1-2 mL 液体培养液中制备。
克隆过程所用培养基为LBkan30 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，卡那霉素30 μg/mL，pH 7.5；发酵培养基为：蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油5 mL/L，KH2PO4 3.8 g/L 和K2HPO4 12.5 g/L，卡那霉素30 μg/mL。
1.3 方法
1.3.1 基因采矿预测DERA 基因
分别以已报道的耐热和高对映体选择性DERA 序列为对象在ENtrez 基因数据中进行DERA 蛋白检索，从中选取预测有DERA 序列的四种芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus subtilis，Bacillus thuringiensis )做为研究对象。
1.3.2 基因克隆及表达
根据种内同源基因为模板进行引物设计，由聚合酶链式反应(PCR)扩增编码DERA 的基因。限制性酶位点NcoI 引入到上游引物起始密码前，限制性酶位点HindIII 引入到下游引物5’末端。PCR 由Primer star DNA 聚合酶进行30 个循环，纯化的PCR 产物先用限制性内切酶消化后插入到预先用同样限制性内切酶消化的pET30a 表达载体上，然后转化到E. coli DH5α 感受态细胞, 并在LBkan30 抗性平板上37℃过夜培养，得到的阳性克隆，提质粒进行基因测序，ORF 正确的表达质粒(如表2)转化感受态表达宿主 E. coli BL21(DE3)，在LBkan30 抗性平板上37℃过夜培养。
挑取单菌落接种到5 mL 发酵培养基中，200 rpm，37℃过夜培养，得到种子液，以2%接种量转接到100 mL 发酵培养基中。当OD600=0.6-0.8，加入IPTG 至终浓度0.5 mM，诱导蛋白表达。诱导6 h 后，在4℃，8000 rpm 离心10 min 收获细胞，细胞储存在-78℃备用。
1.3.3 脱氧核糖醛缩酶的分离纯化
用冰上预冷了的缓冲液A (20 mM 磷酸钠缓冲液，500 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 7.5)按10 mL/g 细胞比例重悬融化的细胞团，置于冰水浴中进行超声破碎。破胞结束后，于4℃下离心(12000 r/min, 20 min)去除细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。
上清液由0.22 μm 的滤膜(Millipore)过滤，用缓冲液A 平衡镍离子亲和层析柱HisTrapTMFF(GE Healthcare，1mL )，流速1.0 mL/min，将粗酶液上柱(约30 mg 蛋白/mL)，用缓冲液A冲洗10 个柱体积后，用缓冲液B (100 mM 磷酸钠缓冲液，200 mM NaCl，250 mM 咪唑，pH 7.5)洗脱，得到酶液I。用脱盐柱(HiTrap Desalting, Amersham)换置酶液I 中的缓冲液为pH7.5，50mmol的盐酸三乙醇胺。纯化的酶用SDS-PAGE 分析，纯度均在95%以上。酶溶液分装后-78℃保存备用。
1.3.4 动力学及酶活测定
体系为 pH 7.5，195 μl 的50 mmol 三乙醇胺盐酸盐溶液，其中含0.3 mmol 的NADH，浓度范围0.25-40 mmol 的底物(DRP/DR)，GPD/TPI 1.7U/ml，于25℃恒温条件下加入5 μl酶溶液开始反应，检测340 nm 处吸光度的变化。
单位酶活定义：在上述条件下，每分钟裂解1 μmol 底物的所需的酶量。
酶活计算公式：酶活(U)( μmol/min)=Ew×V×106/(6220×L)
比活计算公式：比活(U/mg pr)=酶活(U)/蛋白量(mg)
Ew：1 min 内340 nm 处吸光度的变化；V：反应液的总体积(L)； 6220：NADH 在340nm的摩尔消光系数(L
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