执业护士护理论文指导：小菜蛾幼虫全长cDNA文库的构建及序列分析

摘 要：以小菜蛾为材料，用SMART技术构建了小菜蛾2龄幼虫全长cDNA文库，对文库的部分序列进行测序及分析，结果表明该文库原始库容达到1.1×106，扩增库容达到2.6×109，重组率达到92%，平均插入片段大小为1kb左右，文库质量达到要求。序列分析得到了小菜蛾的部分新基因，对第11号基因(GenBank登录号：GU014922)表达产物的结构分析预测表明该基因可能为丝氨酸蛋白酶家族基因的一个新成员，参与小菜蛾体内重要的代谢、免疫反应。该文库的构建为进一步研究小菜蛾功能基因奠定了基础。
　　
　　关键词：小菜蛾；全长cDNA文库；EST序列；序列分析；丝氨酸蛋白酶
　　
　　
　　
　　小菜蛾（Plutella xylostella）属鳞翅目菜蛾科昆虫，主要为害十字花科蔬菜，给农业造成严重损失。小菜蛾繁殖力很强，每年发生数代甚至数十代，加之化学农药的大量施用，因此抗药性发展特别快（罗雁婕等,2008）。而现有的生物农药对小菜蛾的防治效果也不是十分理想，尤其对于老熟幼虫期以后的害虫药效差、击倒速度慢等也是当前部分生物农药存在的问题（李高平等，2006）。未来杀虫剂的开发研制越来越趋向于依靠分子生物学技术的发展创新，通过研究目标害虫的功能基因从而找到适合的靶标，研制出针对性更强、效果更好的新型生物农药或对环境友好、高效低毒的化学农药（郑冬梅,2006；邱德文,2007）。而cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工具，本研究拟利用SMART技术，构建小菜蛾2龄幼虫全长cDNA文库，为研究与小菜蛾抗性形成、免疫等相关的重要的功能基因打下基础。
　　
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料和试剂：
　　
　　1.1.1 材料：小菜蛾成虫捕捉于重庆地区蔬菜地，在实验室条件下饲养两代，取2龄幼虫作为供试材料。
　　
　　1.1.2 主要试剂：Creator SMART cDNA Library Construction Kit 购自Clontech公司，TRIZOL试剂、T4 DNA连接酶购自Invitrogen公司，mRNA纯化试剂盒、核酸共沉剂、sfiⅠ限制性内切酶购自TaKaRa公司，PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。
　　
　　1.1.3 引物序列根据Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用说明书，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：建库引物①SMART IV Oligonucleotide 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3'②CDS III/3' PCR Primer 5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'③5' PCR Primer 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'；检验引物①M13 Forward Primer5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'②M13 Reverse Primer 5'-AAACAGCTATGACCATGTTCA-3'
　　
　　1.2 方法
　　1.2.1 总RNA 和 mRNA提取：按照TRIZOL试剂使用说明操作，将提取的总RNA用65℃、100μL DEPC水溶解，取适量RNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测总RNA的质量。然后用mRNA提取试剂盒从总RNA中提取mRNA，在最终的mRNA提取液中加入4%（V/V）核酸共沉剂，置-20℃沉淀过夜。第二天冰冻离心回收mRNA沉淀，用10μL DEPC水溶解mRNA沉淀备用。
　　
　　1.2.2 dscDNA的合成与分级分离：根据Creator SMART cDNA Library Construction Kit使用说明书操作，以mRNA为模板,在CDS Ⅲ/ 3pPCR 引物和SMART Ⅳ寡核苷酸引物的引导下,通过逆转录酶合成第一链cDNA，再以第一链cDNA为模板,加入CDS Ⅲ/ 3p PCR 引物和5p锚定引物,用LA-Taq酶经过LD-PCR(long distance polymerase chain reaction)合成第二链cDNA。反应结束后取5μLPCR 产物用1%的琼脂糖电泳检测。将双链cDNA以PCR产物纯化试剂盒纯化后加入适量sfiⅠ酶切掉引物两端的序列，酶切后的双链cDNA经过1.2%的琼脂糖凝胶电泳，回收500bp以上的片段。
　　
　　1.2.3 dscDNA与载体连接后电转化：用T4 DNA连接酶将cDNA与试剂盒中提供的载体按照一定比例相连接。按照一般感受态细胞制备的方法制备大肠杆菌XL1-BLUE感受态细胞，验证转化效率后，将cDNA与载体连接后的产物经过初步纯化后与感受态细胞混合进行电转化，电转化产物经过复苏后铺板，37℃生长12h。
　　
　　1.2.4 文库验证和保存：进行文库库容量的计算，随机挑取单菌落进行菌落PCR，验证文库重组率及插入片段大小。用含氯霉素的LB液体培养基洗平板上的菌落，混匀后加甘油速冻保存于-80℃。
　　
　　1.2.5 EST测序及分析：随机挑取60个单克隆分别接种于加氯霉素的LB液体培养基，37℃摇床250rpm培养10h后加甘油保存菌种，将甘油菌送到南京金思特生物技术公司进行正向测序，测序引物为T7引物。将测序得到的EST序列用Crossmatch软件去除载体序列，用phrap软件对序列进行聚类拼接，处理后用NCBI的BlastX和BlastN程序进行相似性比对，并对序列进行GO注释。
　　
　　1.2.6 基因分析：根据基因相似性比对结果用NCBI在线预测基因表达蛋白的一级结构、二级结构、保守结构域，用SinglP在线预测基因表达产物的信号肽。
　　
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2.1 总RNA及mRNA质量
　　总RNA经过凝胶电泳分析表明28S和18S条带清晰无拖尾，两者亮度之比约为2:1，说明所提RNA完好无降解，紫外分光光度计检测OD260/OD280=1.80～2.0，可以用来进行文库构建。从总RNA中纯化得到的mRNA经过紫外分光光度计检测，OD260/OD280=1.80～2.0。
　　
　　2.2 dscDNA
　　首先对dscDNA扩增程序进行了优化，比较LD-PCR过程中18-30个循环的dscDNA扩增效果，得出21个循环的扩增效果最好，如图2所示，电泳检测dscDNA弥散分布于0.2kb～4.5kb，表明该时期转录的mRNA复杂多样，其中分布的数条明显条带代表高丰度表达基因。扩增产物经紫外检测OD260/OD280=1.7～1.9。
　　
　　2.3 文库质量
　　对文库随机挑取的单菌落进行菌落PCR，如图3所示，凝胶电泳检测结果显示外源片段大小主要分布在0.75～1.5kb，外源片段插入率为92% ,平均长度为1kb左右。对文库涂板后菌落数量的计算得到原始库容为1.1×106，扩增后的库容达到2.6×109，达到文库的质量要求（王昆等，2005）。
　　
　　2.4 文库测序及序列比对
　　随机挑取的60个克隆测序后得到55条高质量的EST序列，对这55条EST序列进行聚类分析及拼接后,共获得30个非重复序列(UniGene)。非重复序列的长度在400～1200bp之间，平均在800bp左右。对这30条序列使用NCBI中的BlastX程序进行本地搜索,结果显示：16条序列与Genebank中已公布的序列有较高同源性，并且这些同源序列多为昆虫的基因；14条序列没有注解。BlastN程序搜索结果表明：10条序列与Genebank公布的序列有较高同源性，20条序列没有注解。这些没有注解的序列为该物种新的EST序列，序列登录工作正在进行中。
　　对30条非重复序列进行GO注释，结果显示：其中有16条序列参与各种分子功能、细胞组成和生物过程，占EST序列总数的53%，其表达产物包括核糖体蛋白、金属蛋白、酶类等在内的10多种产物，主要为核糖体蛋白、孵化酶、延伸因子等。
　　
　　2.5 第11号基因（GenBank登录号：GU014922）及其表达产物的生物信息分析
　　在所获得的非重复序列中第11号基因与多种昆虫胰岛素类似的丝氨酸蛋白酶基因有较高的相似性，相似性得分最高的为123分的鳞翅目螟蛾科玉米螟胰岛素类似的丝氨酸蛋白酶T22基因，其次为得分117分的鳞翅目夜蛾科棉铃虫胰蛋白酶基因，排名第三的为得分116分的小菜蛾类胰蛋白酶，NCBI网站对相似性较高的前6个基因的注释相同：该基因表达产物为无活性的酶前体，经过限制性蛋白水解酶加工后转变为有活性的酶，参与代谢反应。根据比对结果及相关文献（Zhu L，et al.2008；Spray F.J，et al.1991；Wu DD,et al.2009）推测该基因的表达产物参与酶联激活反应，可能与小菜蛾的重要代谢、免疫反应及抗性形成相关。利用NCBI网站生物信息学数据对所得非重复序列中第11号基因表达蛋白的一级结构预测，结果显示，所得第11号基因包括开放阅读框中的708个碱基，编码236个氨基酸，分子量为24720，等电点6.89。SignalP网站在线预测信号肽结果显示，序列的前17个氨基酸组成完整的信号肽，推测这与该基因参与酶联激活反应有关，信号肽介导无活性的酶前体的运输，酶前体经过修饰后变成有活性的酶。
　　对第11号基因表达蛋白的二级结构、结构域预测结果显示，该基因表达蛋白的二级结构包含4个α螺旋、11个β折叠、13个loop结构。保守结构域预测显示第67位氨基酸和第116位氨基酸附近有两个活性位点为保守结构域，该结构域与丝氨酸蛋白酶超家族的保守结构域相似。推测该基因可能为丝氨酸蛋白酶超家族基因中的一个新成员。
　　
　　
　　3 讨 论
　　
　　自cDNA文库问世以来，cDNA文库就成为研究功能基因组学的基本方法之一，它能使我们高效、快速地获得大规模的基因序列信息，而且其中的全长序列大大提高了测序和生物信息学预测的进程，也有利于以后的蛋白质表达分析（Umezawa T,et al.2008）。相比以往的建库方法，本实验中采用ＸＬ１－Ｂｌｕｅ菌株制备超级感受态细胞，使得电转化效率大大提高。考虑到小菜蛾生活史短，许多农药包括生物农药对于幼虫3龄以后的害虫防效较差（李高平等,2006），所以选取2龄幼虫为建库材料。测序是目前应用很广泛的寻找新基因的手段，测序获得的表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是来源于一定环境下一个组织的cDNA序列(Hao GP,et al.2009)。每一个EST序列代表一个表达基因的部分转录片段，通过对序列的分析可以获得大量的基因表达信息。cDNA文库建设只是发现基因和研究基因功能的基础工作，文库建成之后的分析预测以及基因功能深入研究才是目的。本实验中对所建cDNA文库测序得到了小菜蛾的部分EST序列，发现其中包括许多未知信息的新的EST序列。对其中部分序列进行了分析，发现所测序列中的第11号基因的表达产物，不论从蛋白质一级结构、二级结构或者结构域推测，都与丝氨酸蛋白酶具有相似性，而丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶,在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用 (Shi XZ,et al.2008;何智等,2004)，参与昆虫体内重要的代谢和免疫反应(Krem MM,et al.2001;王英,2006;程廷才,2008)，所以我们推测第11号基因是丝氨酸蛋白酶超家族基因中的一个新基因(GenBank登录号：GU01492)，可能参与小菜蛾体内重要的代谢或免疫反应，其具体的功能还有待于进一步深入研究。随着文库大规模测序的展开，必将有更多的新基因被发现。来源: