执业护士护理论文指导：模拟微重力环境对大鼠神经干细胞粘附能力

　　摘要：本实验目的在于研究模拟微重力环境对鼠源神经干细胞（neural stem cells，NSCs）粘附能力以及Ca2+-ATPase 活性的影响，探讨微重力环境对神经干细胞互相联系，细胞稳定性的影响。实验通过提取新生1 天SD 大鼠海马组织来源神经干细胞，原代培养7 天后一组置于回旋器中模拟微重力环境，另一组作为正常重力对照组，在1-5 天内对两组细胞分别取样，通过倒置显微镜观察1-5 天内神经干细胞聚集成球大小直径，流式细胞术检测粘附相关分子整合素的表达量以及蛋白酶法检测Ca2+-ATPase 活性变化。结果显示模拟微重力环境中NSCs 细胞成球直径，整合素的表达量以及Ca2+-ATPase 活性均明显大于正常重力对照组。因此，微重力环境能够增强NSCs 细胞的粘附能力，提高Ca2+-ATPase 活性，有助于细胞相互联系。
　　
　　关键词：模拟微重力；神经干细胞；粘附能力
　　
　　
　　1 引 言
　　
　　太空是一个高真空、超低温和微重力的环境,在太空中由于所有物体都表现不出重量,细胞的性状会发生各种变化,进而影响其结构和功能。动物细胞在微重力环境下会发生显著的变化。这些变化包括细胞形态、分子内部应力等的调整与改变。在哺乳动物中，中枢神经系统能够协调和整合机体多种生命活动，在各大系统中处于核心地位。在动物神经系统的发育过程中，重力因素一直参与其中，但其发挥的作用及其机制并不明确。神经干细胞（neuralstem cells，NSCs）是中枢神经系统中具有自我更新能力和多种分化潜能的特殊细胞群，存在于胚胎和成年哺乳动物的中枢神经系统中，在一定条件下可以增殖、迁移并且分化为神经元和胶质细胞，与中枢神经系统的发育密切相关。整合素是细胞外基质中重要的组成部分，是一种亲异性细胞粘附分子，主要介导细胞与细胞外基质间的粘附，或者是细胞与细胞间的粘附，并介导信号传递从而参与细胞的多种生理功能，如细胞的识别、生长、分化、伸展与迁移、淋巴细胞的归巢以及肿瘤的侵袭和转移等方面。Ca2+是细胞内的第二信使，在维持细胞内各项生理活动中发挥重要的作用，而细胞内外的钙稳态是钙发挥生理效应，保持细胞稳定状态的关键。Ca2+-ATPase 在维持细胞内外Ca2+正常浓度中起重要作用。本实验旨在研究模拟微重力环境对神经干细胞粘附能力以及Ca2+-ATPase活性的影响，为进一步的研究奠定基础。
　　
　　
　　2 材料和方法
　　
　　2.1 实验材料
　　DMEM/F12 培养基和B27 添加剂购自Gibco 公司，表皮生长因子(EGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Peprotech 公司，DAPI、多聚赖氨酸、胎牛血清、免疫山羊血清、多聚甲醛、Triton- X100 均购自北京拜尔迪生物技术有限公司，Ca2+-ATPase 活性测定试剂盒购自北京纵横洋洲医药生物有限公司，鼠抗integrins 和羊抗鼠IgG-FITC 均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，实验动物为新生1天SD大鼠，购于北京大学医学部实验动物部。SM-31 双轴驱动框架式回转器，中国科学院空间科学与应用研究中心研制。
　　
　　2.2 大鼠神经干细胞的培养
　　解剖新生一天的SD 大鼠，（提前埋入冰盒约30min）拿入超净台操作。解剖老鼠头部并取出海马组织放入盛有4℃ D-Hank’s 液的35mm 无菌培养皿中。待所有大鼠海马组织都提取完毕，用移液器小心吸出D-Hank’s 液，用直头镊子剔除明显的血管，再用直头剪将组织剪碎至1mm3 左右的小块。去掉D-Hank’s 液，直头剪剪碎组织到1mm3 左右大小。加入组织消化液覆盖组织块，37℃消化10min。加入终止消化液并离心，2000rpm 离心5min，弃去上清，用DMEM/F12 培养基（2% B27，20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，100U/ml 青霉素/链霉素）轻轻重悬起沉淀。待吹散均匀后用200 目不锈钢细胞筛过滤。台盼蓝染色细胞计数后接种于细胞培养皿，37℃，5% CO2 细胞培养箱中培养，3-4 天进行半量换液。
　　
　　2.3 模拟微重力环境的体系的建立
　　实验中采用 SM-31 双轴驱动框架式回转器来模拟微重力条件，内外框的转速均为15rpm。将从SD 大鼠海马组织来源的神经干细胞原代培养7 天，将其分为两组，一组置于回转器中作为模拟微重力组，另一组常态培养作为正常重力对照组。
　　
　　2.4 倒置显微镜观察NSCs 细胞聚集形态变化
　　将原代培养 7 天的大鼠神经干细胞平行分为模拟微重力组和正常重力对照组。在细胞生长的1-5d 内，每天对微重力和正常重力培养的神经干细胞取样，倒置显微镜下观察，并用Image pro plus 软件对其直径变化进行统计处理。
　　
　　2.5 流式细胞术检测NSCs细胞表面粘附分子整合素β1 的表达量
　　将原代培养 7 天的大鼠神经干细胞平行分为模拟微重力组和正常重力对照组，继续培养5 天。之后分别离心收取生长5 天的神经干细胞，室温下4%多聚甲醛固定30min。PBS 洗3次，5 min/次。加入PBS稀释的一抗（兔抗integrins）、10%山羊血清封闭液和0.3%Triton-X100于37℃培养箱内孵育2h。PBS 洗3 次，10 min/次。加PBS 稀释的二抗IgG-FITC，37℃避光孵育30min。PBS洗3次，5min/次。流式细胞术检测。
　　
　　2.6 蛋白酶法检测NSCs 细胞Ca2+-ATPase 活性的影响
　　将原代培养 7 天的大鼠神经干细胞平行分为模拟微重力组和正常重力对照组。在细胞生长的5 天内，对每组细胞分别在1h，12h，24h，72h，120h 取样，超声破碎仪破碎细胞并离心，弃沉淀收集上清。上清液用考马斯亮蓝法蛋白定量后，按照Ca2+-ATPase 活性试剂盒说明书测定。
　　
　　
　　3 结 果
　　
　　3.1 模拟微重力对鼠源神经干细胞聚集能力的影响
　　连续5天从倒置显微镜中观察细胞聚集情况，实验结果显示，模拟微重力环境中生长的大鼠神经干细胞球明显大于正常重力对照组，并且随着生长时间的不断增加，差距更加明显。模拟微重力环境和正常重力环境中生长1-5d 的大鼠神经干细胞所形成的神经球平均直径结果显示，正常重力环境中生长1-5d 的大鼠神经干细胞球平均直径的增幅约20μm 左右。而模拟微重力环境中生长的神经干细胞球的平均直径在1-2d 内的变化与正常重力环境中生长的神经干细胞球的平均直径变化没有明显差别。而模拟微重力环境中生长的神经干细胞球的平均直径在3-5d 内的增幅在100μm 以上，明显高于正常重力对照组。此实验结果提示神经干细胞在模拟微重力环境中更加容易聚集形成的神经球。
　　（A）正常重力环境中生长1 天的神经干细胞球，×100；（B）模拟微重力环境中生长1 天的神经干细胞球，×100；（C）正常重力环境中生长2 天的神经干细胞球，×100；（D）模拟微重力环境中生长2 天的神经干细胞球，×100；（E）正常重力环境中生长3 天的神经干细胞球，×100；（F）模拟微重力环境中生长3 天的神经干细胞球，×100；（G）正常重力环境中生长5 天的神经干细胞球，×100；（H）模拟微重力环境中生长5 天的神经干细胞球，×100；
　　
　　3.2 模拟微重力对NSCs 细胞表面粘附分子整合素β1 表达的影响
　　通过流式细胞术测定整合素β1 表达情况，结果显示，在模拟微重力环境中培养5 天的鼠源神经干细胞，其整合素的表达明显高于正常重力对照组。
　　
　　3.3 模拟微重力对NSCs 细胞Ca2+-ATPase 活性的影响
　　本实验实验结果显示，在24 小时之内，模拟微重力环境中神经干细胞的Ca2+-ATPase活性明显高于正常重力对照组。在第二天开始明显微重力组Ca2+-ATPase 活性明显降低，并在随后的2-5 天之间，模拟微重力组Ca2+-ATPase 活性开始逐渐降低，并与正常重力对照组无显著差异。
　　
　　
　　4 讨 论
　　
　　神经干细胞是神经系统中一类具有自我更新能力和多分化潜能的细胞。研究发现神经球之间和神经球内部细胞之间存在着广泛的异质性。神经球是神经干细胞体外培养于含有有丝分裂原组织培养液中表现出的一般形式，该悬浮球状细胞团中的细胞被认为保持了神经干细胞的基本增殖和分化特性。研究证明神经球并非神经干细胞的单克隆群体，神经球的发生除了细胞增殖外，还包括细胞重聚团、神经球融合等方式，其形成过程也有诸多因子参与影响。整合素（integrin）是细胞粘附分子中一类重要的细胞表面受体家族，主要介导细胞与胞外基质的粘附或者是介导细胞间的粘附，借此作为介导信号传递的膜分子并进行一些列胞内蛋白激活、信号转导，参与细胞的多种生理功能。整合素在动植物细胞中广泛表达，是由α（120-185kD）和β（90-110kD）两个亚单位形成的异二聚体。迄今已发现16 种α 亚单位和9 种β 亚单位，它们按不同的组合构成20 余种整合素。其中含β1 亚单位的整合素主要介导细胞与细胞外基质成分之间的粘附。Masini 等研究者发现，微重力环境可以使神经胶质细胞整合素表达增强。细胞膜Ca2+-ATPase 通过分解ATP 将钙离子跨膜转运到细胞外；内质网上的Ca2+-ATPase 通过水解ATP 将细胞溶质内的钙离子逆浓度梯度泵入内质网。Ca2+-ATPase 是调节细胞内Ca2+浓度的重要蛋白之一，其作用是将导致细胞收缩的胞浆Ca2+转运到内质网中储存，这是一个主动运转的过程，需要消耗ATP 提供能量，Ca2+-ATPase每转运两个Ca2+需要消耗一分子大ATP。钙离子是最重要的细胞内信使之一，细胞内钙离子稳定对维持细胞正常的生理生化过程至关重要。细胞内Ca2+-ATPase 活性对于维持细胞内Ca2+浓度的稳定性有重要作用，其活性会影响到细胞的许多生理功能及细胞的完整性。
　　本实验结果显示，模拟微重力环境中培养5 天的鼠源神经干细胞，其细胞聚集形成的神经球直径明显大于正常重力对照组。同时整合素β1 表达量增加。这提示模拟微重力环境能使细胞之间的粘附能力增强，细胞更容易聚集成球，细胞之间的联系更加紧密，这就可能有助于细胞之间的相互联系和信号传导。短期模拟微重力环境能够明显提高大鼠神经干细胞Ca2+-ATPase 活性，随着天数的增加，模拟微重力环境中NSCs 的Ca2+-ATPase 活性开始下降，并且与正常重力对照组相比没有明显差异。这有可能是细胞逐渐适应微重力环境的表现。综上所述，模拟微重力能够增强NSCs 细胞的粘附能力并提高Ca2+-ATPase 的活性。本研究做了对模拟微重力环境对鼠源神经干细胞粘附作用的初步探究，具体的原因及生物学效应还有待进一步的探究。来源: