碳酸氢盐人工肾透析液的细菌内毒素检测

目的建立碳酸氢盐人工肾透析液的细菌内毒素检查方法，以控制药品质量，防止菌血症和热原的发生。方法根据中国药典2000年版二部细菌内毒素检查法的要求进行实验。结果将碳酸氢盐人工肾透析液1∶4稀释后，可消除干扰作用。结论在1∶4倍的稀释度下，可用灵敏度为0.125 Eu·mL-1的鲎试剂对样品进行细菌内毒素检查。
血液透析适用于急性肾衰竭、慢性肾衰竭、急性中毒和高尿酸血症等，特别对终末期肾衰竭患者，血透是其治疗的重要手段。有报告指出，若进入人体血液的内毒素高于每千克体重1 ng(5 EU)，除了会发冷发热外，亦会造成低血压、肌肉痛、恶心、呕吐等热原反应的各种症状，甚至危及生命，如败血症性休克或器官衰竭[1] 。为了保证产品质量和临床使用安全，我们通过加入活性炭和用孔径为0.3 μm的微孔滤膜过滤等措施，使配制的透析液无热原。本试验对碳酸氢盐人工肾透析液进行干扰试验，建立反应灵敏、快捷简便的细菌内毒素检查方法
。
1 仪器与材料

1.2.1 鲎试剂(TAL)

TAL1：湛江安度斯生物有限公司，规格为0.1 mL/支，灵敏度(λ)＝0.125 Eu·mL-1；TAL2：广西北海制药厂，规格为0.1 mL/支，灵敏度(λ)＝0.125 Eu·mL-1.
1.2.2 细菌内毒素检查用水(WBET)

湛江安度斯生物有限公司，规格：2 mL/支，内毒素含量<0.0015 Eu·mL-1。
1.2.3 内毒素工作标准品(WSE)

中国药品生物制品检定所，100 Eu/支，批号。
1.2.4 碳酸氢盐人工肾透析液

A液,规格：5000 mL/桶，；B液,规格：7000 mL/桶.
2 实验方法与结果

2.1 内毒素限量

按照《中国药典》2000年版的规定L＝K/M，其中K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K为5 Eu /(kg·h);M为人用每公斤体重每小时最大剂量。按灭菌制剂的要求计算碳酸氢盐人工肾透析液的细菌内毒素限值：M=10 mL/(kg·h)，L＝K/M=0.5 E u·mL-1。最大稀释倍数MVD=L/λ=0.5/0.125=4。

2.2 鲎试剂灵敏度(λ)的复核[2]

用WBET将细菌内毒素工作标准品溶解，置旋涡混合器上混合15 min，分别制成2.0、1.0、0.5、0.25 λ共4个浓度的内毒素标准溶液，按照中国药典2000年版二部规定的方法操作，试验结果见表1。表1 TAL灵敏度复核结果(略)

按公式：λC=lg-1(ΣΧ/4)计算鲎试剂灵敏度的测定值，结果λC为0.125 Eu·ML-1。05λ<λC <2λ，此批鲎试剂符合规定，可用于实验。
2.3 供试品干扰试验

2.3.1 供试品干扰初筛试验

取鲎试剂和细菌内毒素工作标准品将A液进行2、4、8倍稀释；同时将B液进行2、4、8倍稀释,此溶液称为NPC系列；在每一稀释度下均制备含有2λ浓度WSE的碳酸氢盐人工肾透析液，此溶液称为PPC系列。以λ＝0.125 Eu·mL-1 的TAL分别与NPC系列和PPC系列反应，并按常规设PC管和NC管各1管，结果见表2。表2 供试品干扰初筛试验结果(略)

表2结果表明：A液在稀释2、4、8倍后，对细菌内毒素检查均无影响；B液在稀释2倍时，样品存在干扰,只有在稀释4倍或更大稀释倍数时，才能消除干扰。考虑到临床用药安全，我们将样品的稀释倍数定为4倍。
2.3.2 样品干扰试验

取两批鲎试剂，按《中国药典》2000年版二部规定的方法进行干扰试验。A、B液各取3批样品分别做4倍稀释，用样品稀释液将细菌内毒素工作标准品稀释成2，1，0.5，0.25λ浓度的系列样品内毒素溶液，即0.25，0.125，0.0625，00312 Eu·mL-1。另外用WBET作同样稀释试验，试验重复4管，同时分别以样品稀释液和WBET作阴性对照，此为NPC和NC管。A液反应结果见表 3，B液反应结果见表4。表3 不同TAL对供试品的干扰试验结果(略)表4 不同TAL对供试品的干扰试验结果(略)

从表3可知：两批鲎试剂的灵敏度均在0.5～2.0 λ之间，且3个批号的碳酸氢盐人工肾透析A液测得的Et值均在0.5～2.0 Es范围内。说明本品经4倍稀释后，对鲎试剂和内毒素无干扰作用。

从表4可知：两批鲎试剂的灵敏度均在0.5～2.0 λ之间，且3个批号的碳酸氢盐人工肾透析B液测得的Et值均在0.5～2.0 Es范围内。说明本品经4倍稀释后，对鲎试剂和内毒素无干扰反应。
2.3.3 供试品的细菌内毒素检查

碳酸氢盐人工肾透析 A、B液各取3批样品用WBET作4倍稀释，使用λ＝0.125 Eu·mL-1的不同批号的TAL按中国药典2000年版二部的方法检查，结果样品管和阴性管均为阴性，阳性管为阳性，样品均未检出细菌内毒素。

3 讨论

本品由A、B两液组成，它们的处方组成如下：

A液：氯化钠 161.3 g, 氯化钾 9.0 g ，氯化钙948 g，氯化镁3.76 g ，冰醋酸 11.06 g, 蒸馏水加至1000 mL。

B液：氯化钠 30.6 g ，碳酸氢钠66 g ，蒸馏水加至1000 mL。

为了使配制出来的透析液达到无热原的要求，本法在10 000级的净化室内配制，在配制过程中加入ω=0.2%针剂用活性炭以吸附水中及原料中的细菌、病毒和致热原。配好的透析液用12层滤纸通过压滤机过滤后，再以孔径为0.3 μm的微孔滤膜过滤，进一步将微粒、细菌、热原等滤掉。

在100级的环境下分装，容器定期消毒，确保分装的成品不受污染。这样配制出来的透析液，经细菌内毒素检查确认均为阴性，用热原检查法复核均符合规定。
透析液，经放置5、10、15、30 d和60 d，采用灵敏度为0.125 Eu·mL-1的TAL进行细菌内毒素检查，结果A液均为阴性，B液除放置60 d为阳性其余的均为阴性。本品B液为弱碱性溶液，容易生菌，需新鲜配制，密闭以防CO2 逸出，不宜保存太久，以防细菌生长而致菌血症和热原反应。为安全起见，我们将A液的有效期定为1个月，B液的有效期定为20 d。本实验证实，碳酸氢盐人工肾透析液4倍稀析后，采用灵敏度为0.125 Eu·mL-1的TAL对其进行细菌内毒素检查，结果稳定、可靠。因此，可用细菌内毒素检查法来控制其质量。